【实验材料】

1. 4-6周龄小鼠（一般<8周龄）
2. 40 µm 细胞滤网，70µm细胞滤网， 0.22 µm滤器。
3. 层粘连蛋白(Sigma, L2020)：制备 150ul /孔（6孔板）10 μg/mL 溶液（1:100 稀释），储备溶液（1 mg/mL 层粘连蛋白，−20°C 下储存）。在 5 mL PBS (1:100) 中稀释 50 μL 1 mg/mL 层粘连蛋白储备溶液，工作浓度为 10 μg/mL。
4. 混合消化液：100倍稀释100X collagenase type I和100X dispase II， 终浓度：1mg/ml collagenase type I和5 mg/ml dispase II的Hanks平衡盐溶液 ，过滤除菌。
5. 提取培养基：DMEM。
6. DRG混合培养基：Neurobasal培养基(Thermo, 10888022)加2% B-27(Thermo, 17504044)、10%胎牛血清、1％双抗和1％L-谷氨酰胺，48h，5ml/孔。
7. DRG换液培养基： Neurobasal培养基+2%B27+1％谷氨酰胺＋1％双抗+20ng/mlNGF（原液1：5000）+ 50µM 5-FU+150µm uridine （以上两项在培养时现加）。
8. 100X collagenase type I (Thermo, 17100-017)：储存液100 mg/ml，500mg+5mL Hanks稀释，100ul到1ml /tube。-20℃存储，有效期6个月。
9. 100X dispase II (Sigma, D4693)：储存液500 mg/ml，1g+2ml Hanks稀释，100ul到1ml /tube. -20℃存储，有效期6个月。
10. 100X 5-FU (Sigma, F0503)：10mg溶入8ml PBS, 得5mM，稀释100倍得50µm工作液。-20℃存储，现用现加入培养基。
11. 66 X uridine (MCE, HY-B1449): 150µl溶入10ml培养基（稀释66倍）得150µm工作液。-20℃存储，现用现加入培养基。
12. 0.5%戊巴比妥钠：0.05g溶于10ml生理盐水。

【实验方法】

1. 组织培养板的层粘连蛋白涂层：提前20min将 150 μL 10 μg/mL 层粘连蛋白溶液滴到6孔板每个孔中心，放入 37°C 培养箱中，直至准备好实验。在孔之间添加水或 PBS。
2. 小鼠备皮：过麻处死，待完全死亡后置入提前预冷的75%乙醇溶液浸泡消毒3~5 min。（注意剪开之后不要用乙醇，会损伤神经细胞）
3. 离断脊柱：沿背部正中线剪开小鼠皮肤，向两侧钝性分离背部筋膜，手术刀片沿韧带棘突交界处迅速离断白色韧带，随后使用刀柄向两侧钝性分离小鼠背部肌肉群，露出肌肉下附着于横突的韧带，刀片分离后，迅速清理周围肌肉组织，刀片离断脊柱。脊柱附带部分肋骨放入含HBSS的10cm大皿，冰上放置。
4. 清理脊柱：使用含双抗PBS冲洗，清除多余血液及肌肉。
5. 分离DRG：（以下操作均在体视显微镜下操作）沿正中线自椎间孔处剪开锥体,分为左右两半; 必要时剪去棘突以方便分离锥体，使用吸入PBS注射器冲洗椎间孔，清理多余血液，即可见侧隐窝；DRG处于侧隐窝内,为淡黄色结节状组织，两端均有神经纤维组织,使用带齿眼科显微镊摄取DRG组织，轻轻提起后使用显微角膜剪（直剪/弯剪）剪断两端神经纤维。
6. 收集DRG：修理多余神经纤维后,将DRG置于6孔板中并补充 DMEM，继续从所有椎间孔收集每个 DRG。
7. 消化：将DRG在10ml混合消化酶溶液中在 37°C 培养箱中摇动（150 rpm）15 分钟，加1ml 10 % FBS DMEM，吹打至看不见大块组织，将细胞悬浮液通过70 µm 细胞滤网过滤。
8. 洗涤：在25°C下300g离心5分钟，后弃去上清.
9. 重悬：弃去上清液，加入2mL混合培养基重悬溶液。
10. 制备单细胞悬液:匀速吹打制成单细胞悬液。
11. 将上述细胞悬液用40 µm 细胞滤网除去大块纤维，300g，2min离心来获取神经元。
12. 弃层粘连蛋白溶液（可重复使用2〜3次），2 mL PBS 清洗培养皿3次，用5ml混合培养基将细胞重悬后接种到层粘连蛋白包被过的6孔板中，放入孵箱。
13. 换液：48小时后，更换为补充换液培养基；此后，每3天更换一次换液培养基。
14. 培养三天后细胞状态达到稳定，可进行后续实验。

【Note】

1. 提取过程中提取培养基全程置于冰上，每只小鼠至少提取20个DRG。
2. 清理椎间孔内的脊髓组织与神经纤维时注意动作轻柔缓慢，以防误将DRG连同脊髓组织与神经纤维一同清理；
3. 5-氟尿嘧啶用于抑制卫星胶质细胞增殖，同时对非增殖性细胞（神经元细胞）影响较小。
4. 培养时宜用35 mm培养皿/6孔板，维持神经元细胞之间的突触的高效连接
5. 吹打次数越少，对于细胞损伤越小。