【实验材料】

1. 40% Percoll溶液： Percoll工作液 + 1×HBSS（4:6稀释） Percoll **工作液：**Percoll原液+10×HBSS（9:1稀释）
2. 预消化液（4 mL/colon，含10 mM EDTA, 1 mM DTT的无Ca2+/Mg2+的HBSS溶液）
3. 消化液（4 mL/colon，含4% FBS，10 mM HEPES，0.5 mg/ml Collagenase IV，0.2 mg/ml DNase I的RPMI 1640溶液）
4. 50X EDTA： 0.5M储存液，HBSS稀释（Sigma, Cat# EDS-100G）
5. 1000X DTT（DL-Dithiothreitol solution）： 1M原液 （Sigma, Cat# 43816-10ML）
6. 100X HEPES：储存液1 M (Thermo, Cat# 15630080)
7. 100X Collagenase IV：储存液50 mg/ml，100mg+2mL HBSS稀释100uL/tube （Sigma, C5138）
8. 100X DNase I：储存液20 mg/ml，40mg+2mL 1640稀释100uL/tube (Sigma, Cat# DN25)

【实验方法】

1. 取正常B6小鼠小肠组织，仔细去除系膜组织，置于冰预冷DPBS中；
2. 用眼科镊子夹住肠道一端，用注射器+剪裁的200μL枪头吸取DPBS插入肠管一端，冲出肠内粪便；
3. 剪去肠道表面脂肪组织和Payer Patch；
4. 纵向剪开肠道，在冰预冷DPBS涮洗数次，至无絮状物脱落，剪成1cm长的小段备用；
5. 肠段加入4 mL预消化液中，37℃孵育20min，水平震荡（130速）；
6. 将肠段和预消化液经过70 μm筛网过滤，流出液即为IELs，细胞计数；
7. 将肠段经PBS涮洗(此步骤重要)后，剪为2~4mm片段；
8. 将小肠段组织加入4 mL消化液，37℃孵育30 min，水平缓慢摇晃**（90速）**涡旋20s；
9. 加入3倍体积冰预冷MACS终止消化；
10. 混合液体在70 μm筛网上过滤（剩余块状组织较多时可研磨），收集流出细胞；
11. 离心500g 10min 20℃，弃上清；
12. 沉淀重悬于10 mL 40% Percoll溶液；
13. 离心1000g，30 min，升1降1，20℃，吸去表层杂质及上清，重悬沉淀；
14. 加入10 mL PBS，过一次70uM筛网，离心洗细胞400g 5min
15. 流式检测细胞沉淀中的淋巴和髓系细胞比例。